《马达加斯加的企鹅》为了给最心爱的弟弟庆祝生日，新秀（克里斯托弗·奈特斯配音）、老大（汤姆·麦格拉思配音）带领新秀和他的好搭档科斯基（克里斯·米勒配音），里戈闯入了最安全的美国黄金储备中心，只是为了在金库的尽头找到唯一出售炸薯条的自动售货机。没想到，他们完成任务没多久，就被一个长着触手的自动售货机吞噬了，然后被运送到了一个神秘的地方。在完全锁定的设施内，四只企鹅遇到了伪装成基因科学家的章鱼戴夫（约翰马尔科维奇配音）。原来戴夫是动物园里的明星章鱼，但随着可爱企鹅的到来，他陷入了失望的深谷。于是戴夫投身于恐怖血清的创造，发誓要对他去过的动物园里的所有企鹅进行报复。老板和他们的伙伴在逃跑的路上被冷风特工救了出来，他们和这些傲慢的人特工将阻止戴夫的阴谋……