《大明锦衣卫2》三年前，李毅的妻子被人杀害后，他隐姓埋名追查凶手。但可惜，三年来一直毫无线索。三年后，李毅的好友周新毕竟帮他查到杀妻凶手的姓名，但就在两人见面时，周新却被神秘杀手暗杀。临死前，周新交给李毅一个盒子。锦衣卫指挥使纪纲是这次暗杀的主谋，在他得悉李毅拿走了关键证明后，转而追杀李毅。另一方面，锦衣卫同知（副指挥使）曹坚也在观察周新死因时将目的锁定在头号嫌疑人李毅身上。站在风口浪尖上的李毅只得一边躲避着纪纲的追杀和曹坚的追捕，一边费尽心血寻找杀妻凶手。